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　　問題分析：超濾離心管常見問題

　　結(jié)果分析：

　　1. 蛋白在濃縮時(shí)出現(xiàn)了沉淀為什么?

　　蛋白如果濃縮過快或者過度濃縮都有可能引起蛋白沉淀。建議蛋白濃縮后的最終濃度不超過20mg/ml. 對(duì)于對(duì)濃縮速度敏感而容易沉淀的蛋白，建議的改進(jìn)方法是：

　　1)離心力降為推薦離心力的30%-50%。

　　2)改選擇下一級(jí)過濾裝置(如原本選用10K，此時(shí)可以選擇30K)

　　3)在濃縮過程中，取出超濾管，用槍頭反復(fù)吹吸幾次。

　　2. 濃縮后發(fā)現(xiàn)濃縮液中沒有目的蛋白，可能的原因是?

　　首先，超濾管的起始蛋白濃度為25ug/ml.

　　請(qǐng)確保樣本的起始濃度大于這個(gè)濃度。

　　其次，如果問題仍然出現(xiàn)。

　　請(qǐng)不要丟棄您的樣本濾過液，

　　以做下一步分析：

　　1)如果樣本在濾過液中，那么請(qǐng)排查：

　　a) 是否選擇了合適截留分子量的超濾管(目的蛋白分子量的1/2或者1/3)?

　　b) 使用的離心力是否是在最高范圍內(nèi)?如果使用的是rpm，請(qǐng)換算成相應(yīng)的g離心，

　　c) 離心機(jī)最近是否有校準(zhǔn)過?

　　d) 是否嘗試這個(gè)蛋白?如果能確保用同樣的超濾管對(duì)其他蛋白成功操作的話， 那么有可能是目的蛋白的原因。有時(shí)蛋白會(huì)因其本身的一些特性(構(gòu)象差異)而影響濃縮效果，建議選用上一分子量級(jí)別的超濾管(如原本選用30K，此時(shí)可以選擇 10K)。

　　2)如果樣本也不在濾過液中：

　　a) 樣本起始蛋白濃度是否大于25ug/ml?

　　b) 用來確定樣本濃度的方法是什么?是否可信?

　　c) 目的蛋白是不是沉淀了?如果是，具體解決方法請(qǐng)參考上面的關(guān)于蛋白沉淀的相關(guān)解決方法。

　　3.用濃縮后的蛋白做下游分析時(shí)發(fā)現(xiàn)有干擾，可能原因?

　　裝置的超過濾薄膜含有微量甘油。如果此材料干擾分析，可用緩沖液或超純水預(yù)清洗。如果干擾仍然存在，用0.1 N NaOH清洗，然后用緩沖液或Milli-Q® 水再次清洗后甩干。

　　4. 有時(shí)候用超濾離心管連水都離不下來，可能原因?

　　裝置的超過濾薄膜含有微量甘油。如果出現(xiàn)這種情況，先用0.1 N NaOH清洗再離心。最后用緩沖液或Milli-Q®水再次清洗后甩干。清洗后的濾膜應(yīng)立即使用， 如暫時(shí)不用，請(qǐng)保持潤(rùn)濕狀態(tài)，避免重新干燥。

　　5.使用超濾管對(duì)蛋白進(jìn)行濃縮的過程中懷疑目的蛋白和膜之間可能存在非特異性吸附，如何改善這一現(xiàn)象?

　　超濾管使用的是再生纖維素膜的材質(zhì)，擁有極低的蛋白吸附能力。但是對(duì)于一些疏水性蛋白或非極性蛋白，它們和膜的非特異吸附可能會(huì)增強(qiáng)，對(duì)于這種情況，客戶可以嘗試在實(shí)驗(yàn)前對(duì)超濾管進(jìn)行封閉處理，詳細(xì)步驟可聯(lián)系廠家技術(shù)支持。

　　同時(shí)也可建議換成Amicon Ultra 0.5來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過減小膜面積來降低非特異性吸附。

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