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　　“elisa試劑盒"常見(jiàn)的問(wèn)題及解答

　　問(wèn)：抗原檢測(cè)出的分子量比資料上的大，是怎么回事?

　　答：a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時(shí)間延長(zhǎng)，可以打開(kāi)二聚體。b)蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等。

　　問(wèn)：蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上，但膠上有，同時(shí)Marker 轉(zhuǎn)上去了，為什么?

　　答：可能是：a)樣品濃度過(guò)低;b)轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠。

　　問(wèn)：磷酸化抗體的檢測(cè)樣本制備時(shí)是否一定要加NaF等?

　　答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般加。但是不加也可以，大部分時(shí)候是不用加的。

　　問(wèn)：要驗(yàn)證某個(gè)細(xì)胞上有無(wú)該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗(yàn)嗎?做這兩個(gè)試驗(yàn)時(shí)的一抗和二抗可以共用嗎?

　　答：①免疫組化可以用來(lái)進(jìn)行定位，但是不能定量，而且有時(shí)會(huì)有假陽(yáng)性，不易與背景區(qū)分;Western blot可以特異性檢測(cè)某個(gè)蛋白質(zhì)分子，進(jìn)行定量，但是不能定位。

　　②兩種實(shí)驗(yàn)的一抗有時(shí)候不能通用，公司的產(chǎn)品說(shuō)明一般都會(huì)說(shuō)明可以進(jìn)行什么實(shí)驗(yàn)，在免疫組化時(shí)，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

　　問(wèn)：做Western Blot時(shí)，提取蛋白后凍存(未加蛋白酶抑制劑)，用的博士德的一抗，開(kāi)始還有點(diǎn)痕跡，現(xiàn)在越來(lái)越差，上樣量已加到120μg，換了個(gè)santa cloz的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎?

　　答：懷疑是樣品問(wèn)題，可能是：1，樣品不能反復(fù)凍融;2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時(shí)，建議檢查Western Blot過(guò)程，提高一抗?jié)舛?。?duì)于加蛋白酶抑制劑來(lái)說(shuō)，一般加PMSF就可以了，能多加幾中種蛋白酶抑制劑。

　　問(wèn)：細(xì)胞水平要做western blot，多少細(xì)胞提的蛋白夠做western blot?

　　答：一般5×10^6就足夠了

　　問(wèn)：同一樣品能同時(shí)提RNA又提蛋白么?這樣對(duì)western blot有無(wú)影響?

　　答：能，沒(méi)有問(wèn)題。

　　問(wèn)：同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測(cè)嗎?

　　答：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品。

　　問(wèn)：如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么?

　　答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑要溫和得多，這時(shí)加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

　　問(wèn)：我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉(zhuǎn)膜時(shí)經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決?

　　答：你可以加大上樣量，沒(méi)有問(wèn)題，還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用減少電流延長(zhǎng)時(shí)間，加20%甲醇。

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